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一、 細(xì)胞和試劑的準(zhǔn)備
1. 細(xì)胞樣品：來(lái)源**細(xì)胞或外周血的白細(xì)胞。
2. 熒光標(biāo)記單克隆抗體：常用的有FITC（fluorescein -isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）標(biāo)記的單克隆抗體。
3. 封閉抗體：抗Fc受體抗體
4. FACS緩沖液：
1×PBS 950 ml
FCS 40 ml
10%疊氮鈉溶液 10 ml
5. 儀器緩沖液（FACS-flow）：儀器廠家提供
6. FACS清潔液（FACS clean ）和FACS洗凈液（FACS rinse）：儀器廠家提供。
二、操作步驟
1. 單細(xì)胞懸液的制備：將1×105~1×107的細(xì)胞放入1.5 m l離心管中3000 r/min 離心5分鐘，棄上清；加入FACS緩沖液100 μl 懸浮細(xì)胞。
2. 封閉細(xì)胞表面Fc受體：在步驟1中加入Fc受體抗體0.5 μl（0.5 mg/ml），水浴3分鐘。
3. 細(xì)胞與熒光抗體結(jié)合：在步驟2中加入熒光抗體1 μl（0.5 mg/ml），水浴30分鐘。
4. 洗細(xì)胞去除游離的熒光抗體：在步驟3中加入FACS緩沖液350 μl，輕輕混勻，3000 r/min，離心5分鐘，棄上清，重復(fù)步驟（4）2次。
5. 上樣前處理：取100 μl 儀器緩沖液加入步驟（4）獲得的細(xì)胞沉淀中，輕輕混勻懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入FACS專用管中，準(zhǔn)備進(jìn)行儀器檢測(cè)和分析。
三、儀器的操作
以FACSCaliburTM（BD Biosciences）儀器為例。儀器主要分為主機(jī)部分（包括激光激活源，射流，射線探測(cè)器）和計(jì)算機(jī)部分（CELLQuest softwere）。儀器的操作分為使用前的準(zhǔn)備、使用中的操作和使用后的清洗。
1.使用前的準(zhǔn)備
（1）打開電源：包括系統(tǒng)電源和主機(jī)部分電源。
（2）檢查供液槽和廢液槽：供液槽應(yīng)含足夠的儀器緩沖液，廢液槽應(yīng)在上次使用后清洗干凈。
（3）使機(jī)器處于負(fù)亞狀態(tài)，才能使細(xì)胞懸液被吸入至機(jī)器的吸管口。
（4）機(jī)器處于可應(yīng)用狀態(tài)時(shí)，指示燈會(huì)變成綠色。
2.使用中的操作
（1） 計(jì)算機(jī)部分—使用CELLQuest程序系統(tǒng)軟件：
①設(shè)定所要檢測(cè)細(xì)胞的數(shù)量：一般設(shè)10 000~20 000個(gè)細(xì)胞。
②命名本次實(shí)驗(yàn)：一般含使用者的姓名和實(shí)驗(yàn)日期。
③打開記數(shù)部分：顯示進(jìn)入的細(xì)胞數(shù)以及檢測(cè)一定量的細(xì)胞所需要的時(shí)間。
④將微機(jī)與主機(jī)連接：控制檢測(cè)時(shí)的預(yù)檢測(cè)和實(shí)際檢測(cè)。
⑤主機(jī)設(shè)定：一般是已設(shè)定好的適合測(cè)定**細(xì)胞的條件，包括探測(cè)器的電壓。探測(cè)器的電壓是調(diào)空光電倍增管所能檢測(cè)熒光密度的范圍。
⑥選擇檢測(cè)的波長(zhǎng)和表達(dá)方式（plot）：如果用一種熒光抗體，一般選直方圖（histogram）；如果用兩種熒光抗體，常選點(diǎn)狀二維圖（dot plot）或輪廓線圖（contour plot）表
CD69分子表達(dá)檢測(cè)直方圖的數(shù)值說(shuō)明
b.abti-CD3（2 ng/ml）檢測(cè)結(jié)果
c.abti-CD3（10 ng/ml）檢測(cè)結(jié)果
CD4及CD8細(xì)胞點(diǎn)狀二維圖結(jié)果
不同的熒光物要求選擇不同的激發(fā)波長(zhǎng)，參見(jiàn)下表
（2）細(xì)胞的吸入：將裝有細(xì)胞的FACS測(cè)定管放置到機(jī)器吸管孔處。
先預(yù)檢測(cè)樣品，然后進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)。可根據(jù)細(xì)胞的濃度選擇測(cè)定的速度（低、中或高）。所有的數(shù)據(jù)將自動(dòng)存入微機(jī)。
3.使用后的清洗 所有樣品測(cè)定完后，要進(jìn)行儀器的清洗。
（1）將裝FACS清潔液的FACS管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入1分鐘。
（2）將裝FACS洗凈液的FACS管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入 1分鐘。
（3）再將裝FACS清潔液的FACS管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入5分鐘。
（4）同樣再將裝FACS洗凈液的FACS管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入5分鐘。
（5）*后將一裝有雙蒸水的FACS管放置機(jī)器吸管孔后，關(guān)閉機(jī)器。
（6）將廢液槽中的廢液倒掉，并清洗干凈廢液槽。
收起
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